Estudio de la actividad antimicrobiana de diversos aceites esenciales y sus principales componentes activos para el control de la infección por Streptococcus suis ; Study of antimicrobial activity of various essential oils and their main active components for the control of Streptococcus suis infection

Streptococcus suis es una bacteria Gram positiva asociada con una amplia variedad de enfermedades en los cerdos, como meningitis, artritis, bronconeumonía, endocarditis, poliserositis y septicemia. Además, es un agente zoonótico emergente que causa infecciones graves en personas en contacto directo con porcinos infectados. Hoy en día, el control se basa fundamentalmente en el tratamiento con antimicrobianos e implementación de medidas sanitarias en la granja afectada. Se ha sugerido que S. suis puede ser responsable de la propagación de genes de resistencia a patógenos humanos importantes como Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus agalactiae. El uso extensivo de antimicrobianos en medicina veterinaria se considera una de las principales causas de la aparición y propagación de microorganismos resistentes. De este modo, la Unión Europea prohibió el uso de antimicrobianos como promotores del crecimiento animal (Comisión Europea, 1831/2003). Una de las estrategias propuestas para la reducción es el uso de aceites esenciales (AE) solos o combinados con agentes antimicrobianos (AMB). Los aceites esenciales son extractos de plantas obtenidos por destilación al vapor y compuestos por una combinación de terpenos, aldehídos y alcoholes, muchos de los cuales son volátiles. La actividad de los AE depende de la concentración de los componentes principales, las partículas presentes en las trazas y la distribución del aceite en las bacterias, lo que determina el tipo de reacción y la respuesta biológica inducida. La acción antimicrobiana incluye la inhibición de una vía bioquímica común, la inactivación de las enzimas microbianas, la filtración de la membrana celular y el aumento de la permeabilidad de la membrana. La investigación de esta tesis doctoral consiste en evaluar el potencial de varios aceites esenciales y sus principales componentes activos como alternativas antimicrobianas contra Streptococcus suis. El primer objetivo fue el estudio cualitativo del potencial antimicrobiano de ocho aceites esenciales contra las cepas de campo de S. suis, mediante la determinación de la zona de inhibición por contacto directo y gaseoso (método de difusión en disco y método de la placa de Petri invertida) y su comparación con el test ANOVA de medias repetidas. Los aceites con una actividad inhibitoria significativamente mayor fueron el tomillo rojo y el tomillo vulgar (Ø media de la zona de inhibición 34,2 y 33,2 mm, respectivamente), seguido de orégano (Ø media de la zona de inhibición 29,4 mm). Canela, menta y clavo (Ø significa 16,5; 16,4 y 15,8 mm, respectivamente) mostraron un potencial antimicrobiano similar, aunque fue significativamente menor que los anteriores. Se obtuvo buena actividad de la fracción volátil de tomillo (rojo y común) y orégano (Ø medio 23,3–25,7 mm), mientras que se observó una débil o nula inhibición para menta, albahaca, romero, canela y clavo. Este es uno de los primeros estudios que selecciona AE con actividad antimicrobiana contra varias cepas de campo de S. suis. Los cuatro aceites con mayor potencial antimicrobiano en el ensayo de difusión en disco se seleccionaron para su estudio cuantitativo. El segundo objetivo de la tesis fue evaluar la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales seleccionados y sus principales componentes activos (carvacrol, timol y cinamaldehído) contra 60 cepas de campo de S. suis, de origen humano y porcino. Mediante microdilución en caldo Infusión Cerebro Corazón (suplementado con un 0,15% de agar para facilitar la dilución de los aceites y la lectura de los resultados) se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) y mínima bactericida (CMB). La relación del efecto concentración-tiempo fue determinada por la curva de muerte de los diferentes productos, para establecer la dinámica de su acción microcida. La susceptibilidad de todos los aislamientos de S. suis analizados en este estudio sugiere un comportamiento muy homogéneo de las cepas frente a los AEs y sus principios activos. Los resultados obtenidos demostraron el carácter bactericida de todos los productos ensayados (índice microcida = 1-2), confirmando el potencial antimicrobiano descrito para otras especies de Streptococcus. Los valores estimados para la CMI90 y la CMB90 destacaron especialmente la actividad del timol y carvacrol frente a los demás productos. Entre los aceites, los mejores resultados se observaron con el orégano y los tomillos. Todos los productos, excepto el cinamaldehido, mostraron una fuerte y rápida actividad, logrando la erradicación virtual (eficacia 99,99%) a dosis de 2 y 4 veces la CMI en sólo 1-5 minutos de exposición. En base a los resultados obtenidos, los productos ensayados en esta tesis tendrían carácter bactericida concentracióndependiente. Como tercer y último objetivo, se evaluó el efecto de la combinación de los aceites esenciales seleccionados y sus principales componentes activos con los antimicrobianos utilizados habitualmente en las granjas porcinas. La prueba de tablero de ajedrez (checkerboard) se usó como base para calcular el Índice de la Fracción de la Concentración Inhibitoria (FCIíndice), cuyos resultados se interpretaron en base a los criterios de la EUCAST (2000). No se detectó efecto antagonista entre los AEs y los antimicrobianos probados. La mayor potenciación positiva se obtuvo para la gentamicina, que mostró sinergismo (0,375-0,5) y aditividad (0,563-1,0) con los cuatro aceites esenciales. En el caso de la oxitetraciclina, los mejores resultados se obtuvieron al combinarla con canela: efecto sinérgico en 2/5 ensayos (0,313 y 0,5, respectivamente) y efecto aditivo en los demás AE. La combinación de penicilina o trimetoprimsulfametoxazol con los aceites esenciales mostró aditividad o indiferencia El estudio de la interacción entre antimicrobianos y principios activos tampoco mostró efecto antagónico, si bien sólo se observó sinérgismo entre la gentamicina y el timol (FCIíndice = 0,5), con una reducción de 4 veces en la CMI de ambos productos. En general, los AMB combinados con AE mostraron mejores resultados que los AMB combinados con los principios activos. Estas diferencias podrían explicarse por la variedad de mecanismos de acción atribuibles a la compleja composición de los aceites esenciales. La interacción positiva observada entre los antimicrobianos convencionales, como la gentamicina y la oxitetraciclina, y los aceites esenciales como la canela, el orégano o los tomillos (vulgar y rojo) respaldarían su uso combinado para el control de las enfermedades por S. suis en granjas porcinas con una importante reducción de la dosis efectiva de ambos productos. ; Streptococcus suis is a Gram-positive bacterium associated with a wide variety of pig diseases, such as meningitis, arthritis, bronchopneumonia, endocarditis, polyserositis and septicaemia. In addition, it is a zoonotic agent that causes severe infections in people related to infected pigs and is responsible for an increasing number of human infections. Nowadays, the control of this microorganism is based on antimicrobial treatment and sanitary measures implemented on the affected farms. It has also been suggested that S. suis may be responsible for the spread of resistance genes to important human pathogens as Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae and Streptococcus agalactiae. The extensive use of antimicrobials in veterinary medicine is considered one of the main causes of the emergence and spread of resistant microorganisms. In order to reduce the use of antimicrobials in pig farming, the European Union banned their use as animal growth promoters (European Commission, 1831/2003). There is an important pressure to reduce the use of antimicrobials in pig farming worldwide, with the aim of avoiding the development of bacterial resistances. One of the strategies proposed for the control of these pathogens is the use of essential oils (EOs) alone or combined with antimicrobials agents (AMBs). Essential oils are extracts of plants obtained by steam distillation and composed by a combination of terpenes, aldehydes and alcohols, many of which are volatile. The activity of the EOs depends on the concentration of the main components, the particles present in the traces, and the distribution of the oil in the bacteria, which determines the type of reaction and the biological response induced. The antimicrobial action includes the inhibition of a common biochemical pathway, inactivation of microbial enzymes, leaking of cell membrane and increasing the membrane permeability. The main goal of present PhD thesis is to assess, among natural products, the potential of various essential oils and their main active components as antimicrobial alternatives against Streptococcus suis. The first objective was the qualitative study of antimicrobial potential of eight essential oils against 20 field strains of S. suis by means of determination of inhibition halo after direct and gaseous contact. Selection of oils with greatest antimicrobial potential for their subsequent quantitative study. The ntibacterial inhibition was determined by the disk diffusion method. Furthermore, the effect of the volatile fraction of every EO was studied with the inverted Petri dish method. The antibacterial activity was evaluated by measuring in millimetres the diameter of the inhibitory zone. The repeated- measures ANOVA test was used for the selection of the four essential oils with the highest antimicrobial potential in the disk diffusion assay. The oils with a significantly higher inhibitory activity were red thyme and common thyme (Ø mean of inhibition zone 34.2 and 33.2 mm, respectively), followed by oregano (Ø mean of inhibition zone 29.4 mm). Cinnamon, peppermint, and clove (Ø mean 16.5, 16.4, and 15.8 mm, respectively) showed a similar antimicrobial potential, although it was significantly lower than the previous ones. Good activity was obtained from the volatile fraction of thyme (red and common) and oregano (Ø mean 23.3–25.7 mm), whereas a limited or absent inhibition was observed for peppermint, basil, rosemary, cinnamon, and clove. This is one of the first studies that selects EOs with antimicrobial activity against several field S. suis strains. The second objective was to evaluate the antimicrobial activity of the selected essential oils (oregano, red thyme, common thyme and cinnamon) and their main active components (carvacrol, thymol and cinnamaldehyde) against 60 field strains of S. suis, of human and porcine origin. The minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) were performing using the broth dilution method, and to facilitate the dilution of the oils and the reading of the results Brain- Heart Infusion broth supplemented with 0.15% agar was used. The concentration-timeeffect relationship was determined by the time-kill curve of different products, to establish the dynamics of their microcidal action. The susceptibility of all the S. suis isolates analysed in this study suggested a very homogeneous behaviour of the strains against the analysed products. The results obtained demonstrated the bactericidal character of all the products tested (microcidal index = 1-2), confirming the antimicrobial potential described by other researches. The estimated values for the MIC90 and MBC90 emphasized the activity of thymol and carvacrol compared with the other products. Among these oils, the best results were observed for oregano and both thymes. All products, except cinnamaldehyde, showed a strong and rapid antimicrobial activity, achieving virtual eradication (99.99% efficiency) at doses of 2 and 4 fold the MIC in 1-5 minutes of exposure. Basing on the results obtained in time-kill curve, the products tested in this thesis would have a concentration-dependent bactericidal character. As a third and final objective of this Doctoral Thesis, we assessed the effect of the combination of selected essential oils and their main active components with the conventional antimicrobials commonly used in the control of infections in pigs. The checkerboard test was used to calculate a Fractional Inhibitory Concentration Index (FICIndex) and the results were interpreted according to EUCAST (2000). No antagonist effect was detected. The best FIC values were obtained with gentamicin, since synergy (FICindex 0,375-0,5) and additive effect (FICindex 0.563-1.0) were detected with the four essential oils. For oxytetracycline, the best results were obtained in the interaction with cinnamon, with synergistic effect in 2/5 assays (FICindex 0.313 and 0.5, respectively) and additive effect in its interaction with the remaining EOs. The combination of penicillin or trimethoprim-sulfamethoxazole with the essential oils showed additive or indifferent effects. The study of the interaction of antimicrobials with active ingredients included 60 combinations. No antagonistic effect was detected, although only a synergistic effect was observed when combined gentamicin and thymol (FICindex = 0.5), with a 4-fold reduction in the MIC of both products. In general, the combination of AMBs with EOs showed better results than the combination of AMBs with the main components of EOs. These differences could be explained by the variety of mechanisms of action attributable to the Essential Oil compounds and the possible synergism between them. The positive interaction observed between conventional antimicrobials, as gentamicin and oxytetracycline, and essential oils as cinnamon, oregano or thyme (common and red) would support their combined use for the control of S. suis diseases in pig farms with an important reduction in effective dose of both products.