Essentielle, funktionelle Domänen im ribosomalen S6-Protein der Eukarya für den Aufbau ribosomaler 40S-Partikel : Essential, functional domains in the ribosomal S6-Protein of Eukarya for the assembly of ribosomal 40S-particles

Funktionelle eukaryontische Ribosomen bestehen aus 40S- und 60S-Untereinheiten. Sie katalysieren als Ribozyme Peptidbindungen. Die Synthese ihrer vier strukturgebenden rRNA-Komponenten und der 80 ribosomalen Proteine findet in unterschiedlichen Zell-Kompartimenten statt. Neusynthetisierte ribosomale Proteine müssen aus dem Cytoplasma in den Zellkern importiert werden, um im Nucleolus, dem Ort der Ribosomen-Biogenese, zu akkumulieren. Die sehr hohe Zahl an Ribosomen in eukaryontischen Zellen erfordert einen schnellen Kernimport und hochspezifische Bindungssequenzen auf allen ribosomalen Proteinen, um mit entsprechenden rRNAStrukturen in Wechselwirkung treten zu können. Untersuchungen in unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass in dem S6-Protein der kleinen ribosomalen Untereinheit mehrere funktionelle Domänen enthalten sind: nucleare Lokalisationssignale (NLS), nucleolare Bindungssequenzen (NoBiS) und die C-terminalen Serin-Phosphorylierungsstellen. Die vorliegende Arbeit analysiert die Rolle dieser Domänen beim Aufbau des ribosomalen 40S-Partikels. Die drei NLS des humanen S6-Proteins sind essentiell für die Bildung aktiver 40SUntereinheiten. Die Deletion von zwei bzw. drei S6-Kernsignalen ermöglicht zwar den passiven Eintritt von S6 in den Kern mit anschließender Bindung im Nucleolus, führt jedoch nicht zu dessen Integration in neugebildete 40S-Untereinheiten. Eine bisher unbekannte, nucleolare Bindungssequenz wurde in der „Homologiedomäne“ des S6-Proteins identifiziert und teilweise charakterisiert. Diese zentral gelegene NoBiS1 besitzt kein NLS. Die Deletion beider nucleolaren Bindungssequenzen von S6 ergibt ein Fragment, das ein Reporterprotein in den Zellkern dirigieren kann, jedoch nicht zur Nucleolus-Akkumulation führt. Die NoBiS von S6 sind evolutionär hochkonserviert, wie Sequenzvergleiche zeigen. Das S6-Protein bindet primär im Bereich der dichten fibrillaren Komponente (DFC) des Nucleolus, wie elektronenmikroskopische Aufnahmen unter Verwendung hochspezifischer S6-Antikörper demonstriert haben, dort findet laut Literatur ebenfalls die Prozessierung der 45S rRNA-Vorläufermoleküle statt. Im Nucleolus gebundene S6-Moleküle sind überraschenderweise in serumstimulierten HeLa-Zellen nicht an ihrem C-terminalen Serincluster phosporyliert, obwohl S6-Kinasen im Zellkern vorhanden sind. Voraussetzungen für die Integration des S6- Proteins in neugebildete 40S-Untereinheiten sind intakte Kernlokalisationssequenzen und nucleolare Bindungssequenzen sowie ein dephosphoryliertes C-terminales Serincluster.

Functional eukaryontic ribosomes are made of 40S- and 60S-Subunits. They as ribozymes catalyze peptide bonds. The synthesis of the four structural rRNA-components and 80 ribosomal proteins takes place in different cell compartiments. Newly synthesized ribosomal proteins must be transported from the cytoplasm to the nucleus to be there after imported into the Nucleolus, the location of ribosome biogenesis. The very high number of ribosomes in eukaryotic cells requires a rapid and highly specific nuclear import and binding sequences at all ribosomal proteins with corresponding rRNA struktures. Studies in our laboratory have shown that in the S6-Protein the small ribosomal subunit includes multiple functional domains: nuclear localization signal (NLS), nucleolar binding sequences (NoBiS) and the C-terminal Serin-phosphorylation cluster. This work examines the role of these domains in building up the structure of the ribosomal 40S-particles. The three NLS of human S6-Proteins are essential for the formation of active 40S-Subunits. The deletion of two or three S6-NLS permits nuclear import while the passive admission of S6 into the nucleus with subsequent retention in the Nucleolus, but without integration into newly synthesized 40S-Subunits. A hitherto unknown, nucleolar binding sequence was found, identified and partially characterized in the "Homologiedomäne" of S6-Proteins. This centrally located NoBiS1 has no NLS. The deletion of both nucleolar binding sequences of S6 fragments and fusion to a reporter protein can conduct transport to the nucleus, but not to nucleolar-accumulation. The NoBiS of S6 are evolutionary highly conserved like sequence comparisons have shown. The S6-Protein binds primarily in the area of the dense fibrillare component (DFC) of the Nucleolus as Electron microscopy images using highly specific S6-Antibodies demonstrated. According to the literature there also takes place the prozessing of the prä 45S rRNA-molecules. In the nucleolus tied S6-molecules are surprisingly not phosphorylated in serum stimulated HeLa cells at their C-terminalen Serin clusters although S6-Kinases are found in the cell nucleus. Prerequisites for the integration of the S6-Proteins in newly 40S-subunits are intact nuclear localization sequence and nucleolare binding sequences and a dephosphorylated C-terminal Serin clusters.